近日，我所生物技术研究部生物分离分析新材料与技术研究组（1809组）叶明亮研究员团队和中国科学院上海药物研究所罗成研究员团队合作，利用蛋白质在结合配体后局部稳定性的变化，开发了一种在复杂体系中可以同时高灵敏鉴定配体结合蛋白和结合位点的蛋白质组学新方法。该方法无需对配体进行化学修饰，广谱适用于包括代谢物、药物、污染物等不同结构配体的靶蛋白质分析。
生物体通过配体与蛋白质上的特定位点结合而实现特定的生物功能，例如，代谢物与蛋白质结合使细胞感知营养状态，药物与蛋白质结合调控机体生理状态等。在细胞内外环境中存在着包括代谢物、金属离子、核酸、蛋白质、药物等各种各样的配体分子，它们与蛋白的相互作用影响生物体的生理病理过程。深入理解配体的结合蛋白质和结合位点有助于揭示配体在生命活动中的作用机制，对认识复杂生命体系、解析疾病机制、推动药物研发等具有重要意义。
传统结合位点和结合亲和力的测定需要重组表达纯化蛋白质，再综合利用核磁、表面等离子共振等技术才能实现，费时费力；且重组表达的蛋白质与细胞中的蛋白质天然状态可能不同，使得测定的结果经常与生理状态有较大的差异。此外，传统配体靶蛋白质组学鉴定方法需要针对不同蛋白质，设计优化保持配体活性的方案，缺乏广谱适用性，且很难鉴定相互作用较弱的靶蛋白。
研究人员发现，采用大量的胰蛋白酶对自然状态下的蛋白质进行酶切，使之直接产生适合质谱检测的肽段，能够对配体结合引起的局部稳定性变化产生放大作用。基于该发现，研究人员开发了以肽段为中心的蛋白质局部稳定性探测方法（PEptide-centric Local Stability Assay，PELSA），用于配体靶蛋白质的鉴定。PELSA方法无需对配体进行化学修饰、不依赖亲和力大小，直接能在细胞裂解液等复杂样品中发现与配体结合发生局部稳定性变化的蛋白质，从而实现配体结合蛋白质、结合位点以及局部亲和力的系统解析。
PELSA方法具有较高的鉴定灵敏度，在模型药物星孢菌素靶蛋白的鉴定中，与现有同类的技术（LiP-MS）相比，利用该方法的靶蛋白鉴定灵敏度提高了12倍；与目前广泛使用但缺乏结合位点信息的热蛋白质组技术（TPP）相比，该方法的靶蛋白鉴定灵敏度提高了2.4倍。此外，剂量依赖的PELSA方法可以测定局部亲和力，从而揭示生理状态下蛋白质在结合配体后三维结构的动态变化。研究人员将PELSA方法用于药物、金属离子、翻译后修饰肽段及抗体等多种配体的结合蛋白鉴定，均展现出高灵敏的靶蛋白鉴定性能和精准的结合区域定位能力，证明了PELSA方法可以作为一个通用的分析平台，研究各种配体与蛋白的相互作用。
由于代谢物种类繁多，结构多样，有些分子结构简单，常以接近细胞生理浓度的亲和力（微摩每升到毫摩每升）与感受蛋白相互作用，二者相互作用的解析长期依赖于生物学家的生物学假设和实验，分析通量有限。本工作开发的PELSA方法非常适合代谢物靶蛋白质的系统鉴定，研究人员利用PELSA方法一次性在HeLa细胞裂解液中鉴定到40个α-酮戊二酸的作用蛋白，其中有30个是大量文献积累的已知作用蛋白，说明该方法靶蛋白鉴定的高灵敏度和高可信度。研究人员进一步将PELSA方法应用于叶酸、亮氨酸、富马酸及琥珀酸等代谢物的作用蛋白鉴定，展示了该方法的广谱适用性。
本工作开发的PELSA方法在代谢物、药物及污染物的识别及作用机制解析等领域具有广泛的应用价值。
近年来，叶明亮团队在靶标蛋白质鉴定方面发展了一系列蛋白质组学方法，包括pH沉淀（pHDPP）、有机溶剂沉淀（SIP）、机械力诱导蛋白沉淀（MSIPP）等变性新方法（Chem. Sci.，2022；Anal. Chem.，2020；Anal. Chim. Acta.，2021），以及矩阵热迁移分析方法（mTSA）（Anal. Chem.，2022）、微球辅助的热致蛋白沉淀（MAPS）（Anal. Chem.，2020）等方法，并应用在鉴定中药紫草素、双青蒿素、持久性污染物全氟辛磺酸、肝毒性化合物格尔德霉素的靶蛋白中。此外，为了能够在蛋白质组水平识别药物结合靶标和结合位点，叶明亮团队还发展了基于赖氨酸反应活性的方法等（Anal. Chem.，2022）。
相关研究成果以“A peptide-centric local stability assay enables proteome-scale identification of the protein targets and binding regions of diverse ligands”为题，于近日发表在《自然-方法》（Nature Methods）上。该工作的第一作者是1809组已毕业博士研究生李柯佳。上述工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、我所创新基金等项目的支持。（文/图 李柯佳、李亚楠、王龑）
